抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（免疫印迹法）

检验原理

本试剂盒将高纯度的重组核抗原和天然抗原印迹于硝酸纤维素膜上。检测时，先将反应膜条与稀释的血清进行孵育，通过抗原-抗体反应将抗体吸附到反应膜条上，未吸附的抗体经过洗涤步骤被去除；然后将反应膜条与酶标抗人IgG抗体进行孵育，再加入酶的底物进行显色反应，如果样品中含有特异性自身抗体，则可通过显色反应检测出来，在反应膜条相应的位置上显示出反应条带。否则，不显示反应条带。

主要组成成分

试剂盒主要由抗原预包被反应膜条，酶结合物(抗人IgG-HRP)、缓冲液、显色液等组成。

试剂盒组成：

反应膜条由检测区（包被RNP68、RNPA、RNPC、SmB、SmD、Ro/SSA60、Ro/SSA 52、La/SSB、Rib-P、PCNA、CENPB、Scl70、Jo-1、Histon、dsDNA抗原)、质控区（包被抗人IgG）及硝酸纤维素膜等支持物构成，其结构见下图：

缓冲液的主要成份有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、NaCl、KCl。

试验所需而未提供的材料：

精密移液器及取样吸头、镊子、一次性试管、蒸馏水或去离子水、漩涡混匀器、摇床、计时器

检验方法

1. 工作缓冲液（A）的准备

（1）工作缓冲液（A）用于血清稀释、酶结合物的稀释及反应膜条的洗涤。

（2）将脱脂奶粉溶于浓缩缓冲液中（1份脱脂奶粉+20份浓缩缓冲液）；然后用去离子水将该混合物补水至终体积（溶解有脱脂奶粉的浓缩缓冲液1份+去离子水9份），制成工作缓冲液（A），如下表1所示。

表1：工作缓冲液（A）的配制方案

例如：1条反应膜条的工作缓冲液（A）用量为20mL，可将0.1g脱脂奶粉溶解于2mL浓缩缓冲液中，然后加入18mL去离子水，制成工作缓冲液（A）。

（3）表中未列出的反应膜条数量所需的工作缓冲液（A）的体积需要计算确定。

2. 酶结合物工作液（B）的准备

（1）酶结合物溶液（B）须现用现配。

（2）1份酶结合物与100份工作缓冲液（A）混合成为酶结合物工作液（B），见下表2。

表2：抗人IgG酶标结合物工作液制备方案

例如：1条反应膜条的酶结合物工作液（B）用量为2mL，可用20μL酶结合物与2mL工作缓冲液（A）混合而成。

（3）表中未列出的反应膜条数量所需的工作缓冲液的体积需要计算确定。

3. 显色液

显色液为即用型。在开始显色反应前将其平衡至室温（18～25℃）。

4.检验程序

将试剂盒恢复至室温（18～25℃），以下所有检测程序均在室温（18～25℃）下进行；

4.1 样品孵育：

（1）在每个反应槽中加入2mL的工作缓冲液（A）；

（2）用镊子将反应膜条小心地完全浸泡到每个装有工作缓冲液（A）的反应槽中，反应膜条的编码应面朝上方；

（3）再用移液器吸取20μL血清样品，加入到对应的反应槽中；

（4）用塑料盖子将反应槽盖好，于室温（18～25℃）下轻微振荡孵育1小时。

4.2 洗涤：

（1）孵育后，小心地将盖子打开，吸去每个反应槽中的反应溶液；

（2）每个反应槽中加入2mL的工作缓冲液（A），在振荡器上轻微晃动洗涤5分钟，吸去缓冲液。

（3）重复步骤（2）洗涤，共3次。

4.3 酶结合物孵育：

洗涤膜条后，在每个反应槽中加入酶结合物工作液（B）2mL，盖好盖子，室温下振荡孵育45分钟。

4.4 洗涤：

吸去酶结合物溶液，按2步骤洗涤反应膜条。

4.5 显色反应：

每个反应槽中加入1.5mL显色液，在室温下轻微振荡孵育1-5分钟，并实时观察，质控线2一旦出现应立刻终止反应。

4.6 终止反应：

（1）吸去显色液，用去离子水清洗反应膜条3次，每次1分钟。

（2）用镊子小心地将反应膜条从水中夹出，并将其放置在2层吸水纸中间干燥。之后将反应膜条与结果判读卡对比，记录阳性条带结果。

（3）使用过的反应膜条应避光保存。

结果解释

将反应膜条质控线1与结果判读卡上的质控线1对齐，之后按照结果判读卡上对应的项目进行判读。

目视或使用自身免疫检测仪进行结果判读，比对反应膜条上显色的条带强度和质控线2的显色强度：

说明：

1.任何情况下只要质控线不显色，结果无效，应重新测试。

2.过量的加样可导致不明确的、无诊断价值的颜色出现，此时应重新测试。

3.由于不正确的样品采集和保存可能得到假阴性结果。