检测原理
本试剂盒采用间接酶联免疫吸附实验技术,检测人血清中的抗核抗体(ANA)。包被抗原为多重纯化核抗原(Sm、RNP/Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、Jo1、U1-SmRNP、CENP-B、dsDNA和Histone抗原),待测样本中的ANA可与之结合。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG作为第二抗体,在固相上形成核抗原-ANA-抗人IgG-HRP复合物,洗去未反应物,加入显色剂产生呈色反应,其颜色深浅与ANA的水平相关,其含量可通过酶标分析仪定性判断结果。
主要组成成份
试剂盒组成
序号 | 名称 | 规格 | 数量 | 组成成份 |
1 | 微孔板 | 96孔 | 1块 | 包被多重纯化核抗原 |
2 | 临界质控品 | 1.2ml | 1瓶 | 0.1M PBS,ANA |
3 | 阳性企业参考品 | 1.2ml | 1瓶 | 0.1M PBS,ANA阳性血清 |
4 | 阴性企业参考品 | 1.2ml | 1瓶 | 0.1M PBS,ANA阴性血清 |
5 | 酶结合物 | 15.0ml | 1瓶 | 抗人IgG-HRP(兔) |
6 | 样本稀释液 | 50.0ml | 2瓶 | 0.1M PBS,Proclin300 |
7 | 浓缩洗涤液(20×) | 25.0ml | 1瓶 | 0.2M PBST |
8 | 显色液 | 15.0ml | 1瓶 | TMB/H2O2 |
9 | 终止液 | 12.0ml | 1瓶 | 0.15M H2SO4 |
10 | 干燥剂 | 0.5g | 1包 | |
11 | 封板膜 | 3片 | ||
12 | 说明书 | 1份 |
注:不同批次的试剂不能混用,不能使用过期的试剂。
试验所需材料但试剂盒未提供
1. 精密移液器及取样吸头;
2. 洗涤瓶,自动化或半自动化的洗板机;
3. 带450nm(参考波长620~650nm)滤光片的酶标仪;
4. 一次性试管;
5. 蒸馏水或去离子水;
6. 纸巾及计时器。
检验方法
样本及试剂准备
1. 将试剂和样本从冰箱中取出,平衡至室温(约30分钟)。
2. 抗原包被的微孔板,直接使用。一次未使用完的板条,为防止受潮,剩余板条应用封板膜封好后,随同干燥剂立即放回铝箔袋内重新密封,2~8℃保存。
3. 临界质控品、阳性企业参考品、阴性企业参考品、酶结合物及样本稀释液,充分混匀,直接使用。
4. 浓缩洗涤液,用蒸馏水或去离子水20倍稀释使用(例如:10ml浓缩洗涤液加190ml蒸馏水或去离子水),临用时配制。若浓缩洗涤液中有结晶析出,稀释前应37℃加温,充分溶解混匀。
5. 显色液、终止液,直接使用。显色液应无色澄清,因对光敏感,使用后应立即盖好瓶盖,若变色,则不能再使用。
6. 血清样本,临用时按1:101比例用样本稀释液稀释,并充分混匀。(例如:10μl血清样本加1.0ml样本稀释液)
实验步骤
1. 加样孵育:按加样设置分别向微孔内加入临界质控品、阳性企业参考品、阴性企业参考品、已稀释样本各100ul, 贴上封板膜,室温(18~25℃)孵育30分钟。
2. 洗涤:手工洗涤 弃去微孔板内液体,用预先配制好的洗涤液,加入300μl,静置30秒后弃去,重复3次,吸水纸上拍干。
上机洗涤 在洗板机上设置洗涤程序,洗涤液400μl,重复3次,取出后吸水纸上拍干。
3. 加酶结合物孵育:微孔板各孔内分别滴加,酶结合物100μl,贴上封板膜,室温(18~25℃)孵育30分钟。
4. 洗涤:弃去微孔板内液体,按流程(2)清洗。
5. 加显色液孵育:微孔板各孔内分别滴加,显色液100μl(2滴),贴上封板膜,室温(18~25℃)孵育15分钟。
6. 终止反应:微孔板各孔内分别滴加终止液100μl(2滴)。
7. 比色:加入终止液后5分钟内,轻微振摇微孔板使孔内液体均匀扩散,酶标仪450nm波长下比色,参考波长为620nm到650nm,并记录OD值。若使用单波长450nm检测时需设置空白对照。